聚丙烯酰胺凝膠電泳色譜儀（簡稱聚丙烯酰胺凝膠電泳儀）的支持介質(zhì)有原性凝膠和變性凝膠。原性凝膠是在凝膠中不加變性劑，蛋白質(zhì)在這種凝膠中的遷移率受它們的靜電荷和分子大小兩個因素的影響，分子量不同，而帶靜電荷相同，可能遷移率相同。因此，在原性凝膠中進(jìn)行電泳不能測定蛋白質(zhì)分子量。變性凝膠是在凝膠中加入變性劑如尿素、十二烷基磺酸鈉（SDS）、巰基乙醇和二硫蘇糖醇等，可破壞或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，把絕大部分蛋白質(zhì)解離成亞基。同時，在蛋白質(zhì)分子周圍包圍了大量負(fù)電荷，掩蓋了無變性劑存在時就有的任何電荷。蛋白質(zhì)在變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對數(shù)成直線關(guān)系，利用變性凝膠進(jìn)行電泳可測定蛋白質(zhì)分子量。目前應(yīng)用較多的變性劑是SDS。

一、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，能破壞蛋白質(zhì)分子間的結(jié)構(gòu)，尤其是在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇存在下使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵還原打開，并以其疏水基與蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合，形成牢固的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物。在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的質(zhì)量結(jié)合比為1.4：1，所引入的凈電荷大約為蛋白質(zhì)本身凈電荷的10倍，使其所帶電荷遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)原有的凈電荷，從而清除或大大降低了不同蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷不同對遷移率的影響。

SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。由蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀近似于雪茄煙形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比，消除了電泳過程中蛋白質(zhì)分子形狀對遷移率的影響。

因此，蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀等因素的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)分子量大小。

蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率與分子量的計算公式為：

lgM = a－bR_f

式中：a為丙烯酰胺單體的質(zhì)量，b為交聯(lián)劑的質(zhì)量，R_f = 蛋白質(zhì)染色后的遷移距離/溴酚藍(lán)在染色后遷移距離。

測定時，通常選用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為標(biāo)記物，與分子量未知的待測蛋白質(zhì)樣品在同一條件下進(jìn)行SDS－PAGE電泳，將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率作橫坐標(biāo)，相應(yīng)分子量的對數(shù)作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。

現(xiàn)在經(jīng)SDS－PAGE電泳測定過的蛋白質(zhì)已有一百多種，具有分辨率高、重復(fù)性好、設(shè)備簡單、操作簡便和快速等特點，已發(fā)展成為蛋白質(zhì)研究的有力工具。在分子量為15000～20000范圍內(nèi)，與用其它方法相比，誤差一般在±10%以內(nèi)。

二、用SDS－PAGE電泳測定蛋白質(zhì)分子量時應(yīng)注意的問題：

1、如果蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物不能達(dá)到1.4gSDS：1g蛋白質(zhì)的比率，并具有相同的構(gòu)象，不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

影響蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的主要因素有：

（1）二硫鍵是否完全被還原：

只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的情況下，SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，并具有相同的構(gòu)象，一般以巰基乙醇作還原劑。有些情況下，還需進(jìn)一步將形成的巰基烷基化，以免在電泳過程中重新氧化而形成蛋白質(zhì)聚合體。

（2）溶液中SDS的濃度：

溶液中SDS的總量至少比蛋白質(zhì)的量高3倍，一般高10倍以上。

（3）溶液的離子強(qiáng)度：

溶液的離子強(qiáng)度應(yīng)較低，最高不能超過0.26。因為SDS在水溶液中是以單體和分子團(tuán)的混合體存在，SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量僅決定于平衡時SDS單體的濃度而不是總濃度，在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體具有較高的平衡濃度。

2、不同的凝膠濃度適用于不同的分子范圍：

在濃度為5%、交聯(lián)度為2.6%的凝膠中，分子量為25000～200000的蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)與遷移率成直線關(guān)系。

在濃度為10%、交聯(lián)度為2.6%的凝膠中，分子量為10000～70000的蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)與遷移率成直線關(guān)系。

在濃度為15%、交聯(lián)度為2.6%的凝膠中，分子量為10000～50000的蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)與遷移率成直線關(guān)系。

濃度為3.33%、交聯(lián)度為2.6%的凝膠可用于分子量更高的蛋白質(zhì)。

可根據(jù)所測分子量范圍選擇最合適的凝膠濃度，并盡量選擇分子量范圍和與待測樣品相近的蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率最好在0.2～0.8之間均勻分布。

影響SDS－PAGE電泳遷移率的因素較多，而在制膠和電泳過程中，很難每次將各項條件都控制得完全一致。因此，用SDS－PAGE電泳測定分子量時，每次測定樣品必須作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、有許多蛋白質(zhì)由亞基或兩條以上肽鏈組成，它們在SDS和巰基乙醇的作用下解離成亞基或單條肽鏈。對于這類蛋白質(zhì)，SDS－PAGE電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的數(shù)據(jù)，必須用其它方法測定其分子量和分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS－PAGE電泳的結(jié)果相互參照。

4、不是所有蛋白質(zhì)都能用SDS－PAGE電泳測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測定的分子量不可靠。這些蛋白質(zhì)有電荷異常和構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)、帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）、一些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（如膠原蛋白）等，因為盡管結(jié)合了正常比例的SDS，但仍不能完全掩蓋其原有電荷的影響。對于這些蛋白質(zhì)，至少要用兩種方法來測定分子量，相互驗證。

   

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